Gradupuintia

Moni sukulainen/tuttava on kysynyt, mitä graduni käsittelee. Vastaan tähän yleensä ympäripyöreästi, että tutkin post-traumaattista epilepsiaa eli miksi jotkut ihmiset sairastuvat epilepsiaan esimerkiksi auto-onnettomuuden jälkeen. Tätä seuraa lähes aina jatkokysymys: Mutta mitä sinä käytännössä teet siellä? Koska hätäpäissään keksitty selitys menee autuaasti ohi suurimmalta osalta, koetan nyt aukaista tekniikoita, joita käytämme. Aion oikoa mutkia roimasti, joten biokemistien on sitten turha motkottaa, etten käsitelly kaikkia molekyylikoneistoja. Kirjoitin käymieni kurssien ja tänä kesänä oppimani pohjalta, mutta siltä varalta, että lukija haluaa selvennystä, laitan tekstin sekaan linkkejä (teksti näkyy tumman punaisena), joita klikkaamalla pääsee selventävälle sivulle. Mutta, mutta, näin tämä kutakuinkin menee:

0. Lyhyt teoria

Aloitetaan biokemistien evankeliumilla:

DNA --> RNA --> proteiini

Toisin sanoen geenit koostuvat DNA:sta, joka puolestaan koostuu nukleotideiksi kutsutuista osista. Nukleotideja on neljää erilaista riippuen siitä minkälainen emäsosa niissä on. Emäkset ovat adeniini (A), tymiini (T), sytosiini (C) ja guaniini (G). Vähän niinkuin tietokoneella on 1 ja 0, geeneillä on A, T, C ja G.

Geenit määrittävät mitä me olemme, joten on meille kaikille edullista, että ne ovat turvassa solun tumassa. Koska lähes kaikki elämälle tärkeät prosessit tapahtuvat solun sisällä, mutta tuman ulkopuolella, täytyy geenien tieto jotenkin välittää tuman ulkopuolelle geenejä vaarantamatta. Tähän tulee apuun RNA. Geeni luetaan (älä kysy miten, tila ei riitä) ja sen emäsjärjestys kopioidaan RNA:han. Tämä niin kutsuttu viesti-RNA kuljetetaan tumasta ulos edelleen käytettäväksi. Tuman ulkopuolella viesti-RNA luetaan (tyydy tähän, muista tilanpuute) ja sen emäsjärjestyksen mukaan rakennetaan proteiini siten, että erityinen molekyylikoneisto tulkitsee järjestyksessä kolme ensimmäistä emästä vastaamaan yhtä aminohappoa, seuraavat kolme jotain toista ja näistä rakennetaan pitkä aminohappoketju, eli proteiini.

Tähän väliin huomautan, että ihmisen DNA on kaksijuosteinen. Tämä tarkoittaa, että kaksi pitkää DNA molekyyliä muodostaa tikkaita muistuttavan mallin, jossa kaksi emästä muodostaa tikkaan puolat siten että A ja T ovat aina vierekkäin, samoin C ja G. Tämä rakenne on huomattavasti pysyvämpi kuin yksinäinen juoste. Samalla myös voidaan säädellä geenien käyttöä, sillä lähetti-RNA:n muodostamista varten rakenne on aukaistava (tikkaat "halkaistaan" osittain). Solu osaa säädellä kaksoisrakenteen aukaisua tarpeen mukaan ja tarpeetomat kohdat ovat suljettuina, jotta vältytään virheiltä.

Sitten hypätäänkin lukiotasolta yliopistoon. Kaikki DNA ei johdakaan proteiinin rakentamiseen. Geenien sisään ja niiden väliseen tilaa oon koodattu myös pieniä pätkiä, jotka käännetään kyllä RNA:ksi, mutta ei proteiiniksi. Muutaman välivaiheen jälkeen niistä muodostetaan mikroRNA:ta (miRNA), eli noin 20 nukleotidia pitkiä ketjuja. Näiden molekyylien tehtävänä on toimia säätelijöinä. miRNA sitoutuu tiettyyn lähetti-RNA:han estäen proteiinin tuottamisen.

Miksi tämä on niin mielenkiintoista? Useiden sairauksien yhteydessä on huomattu, että potilaiden elimien miRNA tasot poikkeavat normaalista. Näiden muutosten takana on osittain elimistön yritys korjata tilannetta, mutta toisaalta osa saattaa aiheuttaa taudin oireita. Jos siis saamme selville mitkä miRNA:t aiheuttavat sairastumisen, voimme yrittää estää niiden toiminnan ja parantaa siten sairauden.

1. RNA eristys

Kyllä, me käytämme koe-eläimiä. Aivotutkimuksessa käytetään paljon rottia ja hiiriä. Minun käyttämäni näytteet ovat rotista. Halukkaat saavat  rauhassa pahoittaa mielensä, kerron oman mielipiteeni jossain tulevassa avautumispostauksessa.

Kudos X suljetaan koeputkeen ja solut hajotetaan liuottamalla ja ravistelemalla, jolloin niiden sisältö vapautuu nesteeseen. Käytän eristykseen hivenen muokattua kloroformiuuttoa. Perusidea on, että näytteeseen lisätään kloroformia, ravistellaan ja erotetaan sentrifuugilla (kone pyörittää näytettä ja eri nesteet kerrostuvat tiheytensä perusteella). Tässä tapauksessa erottuu kolme kerrosta: ylimpänä on vesifaasi, johon vesilliukoinen DNA ja RNA jää. Keskellä on valkoisena saostumana proteiinit ja alimpana kloroformi ja kaikki loput solun ainesosat. Tästä on helppo vakaalla kädellä pipetoida ylin kerros toiseen putkeen. Tästä eteenpäin käytän ns. valmiskittiä. Toisin sanoen tietyt yritykset myyvät välineitä mm RNA:n eristykseen. Nämä välineet ovat yleensä tehokkaampia kuin perinteinen eristys ja lopputulos on puhtaampi. En halua kummemmin mainostaa mitään tuotetta, joten kerron yleisperiaateena, että RNA:ta puhdistetaan etanolilla ja sentrifugoidaan pienen siivilän avulla niin että lopputuloksena on puhdasta RNA:ta. 

2. cDNA synteesi

Seuraavaksi RNA käännetään DNA:ksi. Miksikö? Koska seuraavat tekniikat sitä vaativat ja samalla saamme eroteltua halutun miRNA.n erilleen. Käytännössä tämä tapahtuu sekoittamalla keskenään osan näytettä, alukkeita, satunnaisia nukleotideja ja erityisiä entsyymejä. Tämä seos laitetaan PCR-laitteeseen. PCR-laite on vähän niinkuin ajastimella toimiva munankeitin; laite osaa lämmittää ja jäähdyttää näytettä halutuin aikavälein. Tämä on olennaista, sillä eri lämpötiloilla säädellään synteesin eri vaiheiden kulkua. Lämpötilat ja aikavälit vaihtelevat riippuen käytettävistä kemikaaleista ja alukkeiden valmistajan ohjeista. Karkeasti voi sanoa, että lämpötilan nosto aukaisee juosteen, lasku auttaa liittämään ne yhteen.

Ensimmäiseksi kaksoisjuoste aukaistaan ja alukkeet kiinnitetään. Aluke on pieni pätkä DNA:ta, joka kiinnittyy tiettyyn, vastaavaan kohtaan RNA:ta. Alukkeita on kaksi ja ne rajaavat halutun osan molekyylistä. Tässä tapauksessa ne kiinnittyvät halutun mikroRNA.n molempiin päihin.

Käänteiskopioijaentsyymii tunnistaa alukkeet ja alkaa rakentaa miRNA:lle paria, aivan kuten DNA:ssa. Lopputuloksena on kaksi yhteenkiinnittynyttä molekyyliä, joista  toinen on haluttu puolisko miRNA:sta käännettynä DNA:ksi

3. qPCR

qPCR eli quantitative PCR eli "määrällinen" PCR mittaa molekyylien määrää. Tätä voi käyttää esimerkiksi sairaan ja normaalin kudoksen erojen selvittämiseen. Laite monistaa uudelleen DNA:ta uusilla alukkeilla. Tällä kertaa kone mukana on fluoresoivaa väriainetta. Jokaisella "kierroksella", kun syntyy uusia DNA-molekyylejä, fluoresenssin määrä muuttuu ja kone rekisteröi muutoksen. Ajamalla ensin standardisuoran, johon laittaa tietystä määrästä DNA:ta tehdyn laimennossarjan, voidaan päätellä tuntemattoman näytteen konsentraation.

4. Tulosten analysointi, reaktioreitit, tilastolliset testit

Tässähän pitää tietää, ettei mikään elämässä ole yksinkertaista. Pätee myös biokemiassa. Yksi ainoa mikroRNA saattaa vaikuttaa satoihin proteiineihin. Jotta saisin selville mihin tällä hetkellä tutkittavana oleva molekyyli vaikuttaa, täytyy minun saada käsiini valtava määrä tietoa kyseisen miRNA:n kanssa yhtä aikaa ilmestyvistä geeneistä, eri reaktioreiteistä, taudeista, jotka saattaisivat liittyä tähän ynnä muuta ynnä muuta.  Lisäksi tietenkin saatujen tulosten täytyy olla tilastollisesti merkittäviä ennen kuin niistä voi vetää johtopäätöksiä. Yleisimmin käytettyjä tilastollisia testejä on Studentin t-testi.

Tiede onkin yhä enenemässä määrin tilastotiedettä ja tietokoneanalyysejä. Lisäksi on olemassa useita tietokantoja, joihin syötetään tutkimustuloksia kaikkien nähtäväksi ja käytettäväksi. Olen vielä jumissa edellisessä vaiheessa, mutta eiköhän tästäkin asiasta tule kirjoitettua seuraavien kuukausien aikana.

Huh-huh, kylläpäs tämä venähti. Tästä lähtien ohjaan kaikki utelijat lukemaan tätä blogia. Pitäisiköhän painattaa käyntikortteja, jossa on blogin osoite?

-Ninni