Vieraskynä: Tarjoavatko geeniterapeuttiset menetelmät ja kantasoluhoidot parannuskeinon tyypin 1 diabetekseen?

Viime viikolla järjestettiin vuosittainen BMTK:n kandintöiden popularisointitilaisuus, jossa ~3. vuoden biokemian opiskelijat esittelevät kanditaatin kirjallisuustutkielman pohjalta tekemiään postereita, esityksiä, blogikirjoituksia jne. Popularisointitilaisuus on kaikille avoin ja mieleisintään popularisointia voi äänestää (äänestykseen osallistujien kesken arvotaan leffalippuja!). Viime vuonna omaa kandintyötään esitteli täällä Toni, tänä vuonna vuoronsa saa Lauri. 

Diabetes – maailmanlaajuinen ja elinikäinen sairaus

Diabetes, tuon sanan tuntevat nykyisin niin monet ja moni tulee vielä sen tuntemaan tavalla tai toisella. Kyseistä tautia sairasti maailmassa noin 380 miljoonaa ihmistä vuonna 2015 ja sairaiden määrä vain jatkaa kasvuaan. Kasvu ei myöskään näytä hidastuvan vaan jopa kasvavan. Syynä valtavaan kasvuun on liikalihavuus, joka altistaa tyypin 2 diabetekselle. (Ilanne-Parikka et al. 2015). 

Diabetes (latinaksi Diabetes mellitus) on sokeriaineenvaihdunnan häiriö ja sitä on lukuisia erilaisia tyyppejä, mutta sen päätyyppejä ovat tyypin 1 ja 2 diabetes. Tyypin 1 diabetes (nuoruustyypin diabetes) on immunologisista mekanismeista ja tyypin 2 (aikuistyypin diabetes) diabetes on elintavoista aiheutuva sairaus. Tyypin 1 diabeteksessa haiman Langerhansin saarekkeiden beetasolujen vahingoituttua autoimmuunitulehduksessa insuliinin tuotanto loppuu vaihtelevalla nopeudella. Tyypin 2 diabeteksessa insuliinin vaikutus kudoksissa on heikentynyt erinäisistä syistä, kuten liikalihavuudesta. Insuliinihormoni säätelee veren glukoosipitoisuutta eli verensokeria alentavasti ja estää sen isot nousut, jotka voivat olla hengenvaarallisia (Ilanne-Parikka et al. 2015). Tässä blogikirjoituksessa keskityn enemmän tyypin 1 diabetekseen, koska se on eri diabetestyypeistä kaikkein vaativin ja hankalin. En myöskään ala syvemmin pohtimaan tyypin 1 diabeteksen aiheuttavaa tekijää, koska siihen on epäilty niin monen eri tekijän yhteisvaikutusta. Haluaisin kuitenkin nostaa esille erään suomalaistutkijan väitöksen vuodelta 2015, joka toi lisätodisteita sille, että enterovirus aiheuttaa tyypin 1 diabetesta (Oikarinen 2015).

Tällä hetkellä tyypin 1 diabetes on elinikäinen sairaus eli siihen ei ole vielä löydetty parannus- tai ehkäisykeinoa. Ainoastaan tyypin 1 diabeteksen (ja sen lievempien muotojen) oireita voidaan hoitaa erilaisilla hoitomenetelmillä. Jo olemassa olevia hoitomenetelmiä on kehitetty esimerkiksi pienentämällä hoitolaitteen kokoa, mutta myös uudenlaisia hoitomenetelmiä sekä diabeteksen ehkäisyä tutkitaan ja kehitellään. Asiaan saattaa kuitenkin tulla muutos jopa lähitulevaisuudessa. Mahdollisia diabeteksen parannuskeinoja saattaisivat olla joko geeniterapeuttiset menetelmät, kuten CRISPR/Cas9-menetelmä, ja kantasoluhoidot tai jonkinlainen niiden yhdistelmä. 

Diabeteksen ennaltaehkäisy CRISPR/Cas9-menetelmällä

Bakteereilta mimikoidussa CRISPR/Cas9-menetelmässä hyödynnetään lyhyitä toistojaksoryppäitä (Clustered regularly-interspaced short palindromic repeat, CRISPR) ja niihin liittyvää Cas9-nimistä endonukleaasia (CRISPR-associated protein 9, Cas9). CRISPR/Cas9-menetelmällä voidaan muokata geneettisesti kohdesoluja poistamalla niistä lyhyitä tai isoja DNA-pätkiä tai lisäämällä niitä, uudelleen järjestellä geenejä, aktivoida geenejä tai tehdä muita modifikaatioita, kuten muokata kromatiineja tai DNA:ta (kuva 1) (Sander & Joung 2014). Tätä voitaisiin hyödyntää siten diabeteksen hoidossa, että muokattaisiin geneettisesti hematopoeettisia kantasoluja, joista muodostuu T-soluja. Geneettisellä muokkauksella pyrittäisiin ehkäisemään T-solujen hyökkäämistä Langerhansin saarekkeiden beetasolujen kimppuun. Tällä hetkellä ei kuitenkaan vielä tiedetä, että mitä geenejä tulisi lisätä tai poistaa T-soluista, jotta ne eivät hyökkäisi omia kudoksiaan vastaan (Schumann et al. 2015). Siitä huolimatta CRISPR/Cas9-menetelmä tarjoaa työkalut T-solujen geneettiseen muokkaukseen.

Kuva 1. CRISPR/Cas9-menetelmän toiminta (a) luonnossa ja (b) laboratoriossa. (c) Esimerkkisekvenssejä crRNA-tracrRNA –hybridistä ja gRNA:sta (muokattu kuva, Sander & Joung, 2014). Transaktivoivan crRNA:n (Trans-activating crRNA, tracrRNA) välillä on vaihtelevia sekvenssejä, joita kutsutaan ”protovälikkeiksi” (Protospacer). Protovälikkeet sisältävät virus-DNA:ta, joka on peräisin Cas-proteiineille tapahtuvasta hajotuksesta eli. ”Kypsä” crRNA  (CRISPR RNA, crRNA) muodostaa tracrRNA:n kanssa opas-RNA:n (Guide RNA, gRNA), joka ohjaa Cas9-nukleaasin spesifiseen kohtaan. Cas9 katkoo tunnistamansa komplementaarisen kaksijuosteisen DNA-ketjun ja korvaa katkomansa DNA-pätkän uudella. Toisenlaiset Cas9-nukleaasit voivat katkoa ei-komplementaarisen juosteen. Cas9:n spesifinen kiinnityskohta on komplementaarinen gRNA:n sekvenssin kanssa (Jinek et al. 2012, Sander & Joung 2014).

Diabeteksen vaurioiden korjaaminen kantasoluhoidoilla

Kantasoluhoidossa hyödynnetään kantasolujen jakautumista ja erilaistumista spesifisiksi soluiksi. Kantasolun jakautuessa muodostuu kaksi tytärsolua, joista toinen on erilaistuva tytärsolu ja toinen on kantasolu (Tirri et al. 2006). Transdifferentiaation eli aikuisen eliön multipotenttien solujen muuttaminen pluripotenteiksi tai jopa totipotenteiksi soluiksi erilaisten transkriptiotekijöiden (kuva 2) avulla saadaan tehtyä ei-kantasoluista spesifisiä soluja, kuten maksasoluista (Ham et al. 2013) beetasoluja.

Kuva 2. (muokattu kuva, Jopling & Belmonte 2011).

Kantasoluhoidoissa luodaan kokonaan uudet insuliinia tuottavat beetasolut kantasoluista tai muista soluista transdifferentiaation avulla. On myös esitetty, että beetasolujen tuhoutuminen voidaan estää ohjaamalla säätelijä-T-soluja istukkaverestä saatavilla multipotenteilla soluilla (Zhao et al. 2012, Han & Craig 2013, Chhabra & Brayman 2013). Vaikka kantasoluhoito näyttää lupaavalta, niin vielä on ongelmia, jotka hidastavat sen käyttöönottoa. Kantasoluhoidon huonoja puolia ovat muun muassa ei-tarpeellisten solutyyppien tai teratooman muodostuminen (Gunawardana 2014).

Molempien yhdistelmä mahdollinen parannuskeino?

Lupaavuudestaan huolimatta molemmat menetelmät vaativat vielä paljon kehittelyä ja moni kysymys on vielä avoin. Voiko esimerkiksi beetasolujen tuhoutuminen vain uusiutua vaikka uudet beetasolut pystyttäisiin luomaan tilalle? Uuden luominen tässä tapauksessa edellyttäisi, että tyypin 1 diabeteksen aiheuttaja on poistettu tai tehty vaarattomaksi. Tyypin 1 diabetesta ei ole kuitenkaan voitu linkittää yhteen ja ainoaan tekijään. Muokkaamalla T-soluja voimme jopa aiheuttaa tyypin 1 diabetesta vakavampia sairauksia. Ajatusleikkinä kuitenkin asia on kiehtova. Ensiksi voisimme muokata T-soluja siten, että ne eivät hyökkäisi enää omien kudosten kimppuun ja sitten loisimme uudet beetasolut vaurioituneiden tai tuhoutuneiden tilalle. Ajatusleikit sikseen ja realismia kehiin, biokemiassa asiat eivät ole niin yksinkertaisia kuin toivoisimme niiden olevan. Saatamme kokea vallankumouksen diabeteksen hoidossa lähitulevaisuudessa, mutta milloin ja minkälaisen – sitä emme voi vielä tietää.

~Lauri~

Kirjallisuusviitteet

Chen YY (2015). Efficient Gene Editing in Primary Human T Cells. Trends in Immunology, 36 (11): 667–669 pp.

Chhabra P & Brayman KL (2013). Stem cell therapy to cure type 1 diabetes: from hype to hope. Stem Cells Translational Medicine, 2: 328–336 pp. 

Gunawardana SC (2014). Benefits of healthy adipose tissue in the treatment of diabetes. World Journal of Diabetes, 5 (4): 420–430 pp.

Han MX & Craig ME (2013). Research using autologous cord blood - time for a policy change. Medical Journal of Australia, 199: 288–299 pp. 

Ham DS, Shin J, Kim JW, Park HS, Cho JH & Yoon KH (2013). Generation of functional insulin-producing cells from neonatal porcine liver-derived cells by PDX1/VP16, BETA2/NeuroD and MafA. Public Library of Science One, 8: e79076. 

Ilanne-Parikka P, Rönnemaa T, Saha MT & Sane T (2015). Diabetes. Kustannus Oy Duodecim, Suomi: Helsinki. 8. uudistettu painos.

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA & Charpentier E (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337 (6096): 816–821 pp.

Jopling C, Stephanie Boue & Belmonte JCI (2011). Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: three routes to regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 12, 79–89 pp.

Oikarinen M (2015). Detection of Enteroviruses in Tissue Samples - Methods and applications in type 1 diabetes. Väitöskirja (väitöspäivä 10.6.2015), Tampereen yliopisto, Acta Electronica Universitatis Tamperensis.

Sander JF & Joung JK (2014). CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology, 32: 347–355 pp.

Schumann K, Lin S, Boyer E, Simeonov DR, Subramaniam M, Gate RE, Haliburton GE, Ye CJ, Bluestone JA, Doudna JA & Marson A (2015). Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1512503112v1–201512503.

Tirri R, Lehtonen J, Lemmetyinen R, Pihakaski S & Portin P (2006). Biologian sanakirja. Uudistetun laitoksen 3. painos. Otava, 307 pp.

Zhao Y, Jiang Z, Zhao T, Ye M, Hu C, Yin Z, Li H, Zhang Y, Diao Y & Li Y (2012). Reversal of type 1 diabetes via islet β cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BioMed Central Medicine, 10: 3, doi: 10.1186/1741-7015-10-3.

Vieraskynä: Mycobacterium leprae ja Schwannin solut

Hei! Tänään esitellään kanditöiden popularisoidut versiot ja minun posteriani voi käydä katselemassa Kontinkankaalla Medisiinan edessä klo 11 - 12. Ystäväni Toni (eli Sane) puolestaan kirjoitti tänne tämän blogitekstin.

Lepra on monin tavoin erityislaatuinen tauti. Ensinnäkin sen seuraukset ovat pahimmillaan karmivat, kuten kuvasta 1 voi nähdä: kudosten liikakasvua ja irtoamista, vakavia epämuodostumia niin käsissä, jaloissa, kasvoissa kuin silmissäkin, peruuttamattomia hermokudosvaurioita sekä lopullista hermojen toiminnan menetystä. Lievimmilläänkin se aiheuttaa pitkäaikaista tulehdusta ihossa ja ääreishermostossa. [1]

Kuva 1. Kudosten tuhoutumisen ja uusiutumisen vaikutuksia lepratartunnan saaneiden käsissä. [2]

Toisekseen taudin seuraukset eivät johdu leprabakteerista eli Mycobacterium lepraesta itsestään, vaan kehon oman immuunipuolustuksen tehottomista yrityksistä tuhota sitä. Niin ironiselta kuin se kuulostaakin, bakteeri on sopeutunut niin hyvin solunsisäiseksi loiseksi, jottei se vaurioita isäntäsolujaan juuri ollenkaan. [3]

Kuten kuvan 2 kartasta näkyy, lepra on vielä nykypäivänäkin merkittävä ongelma etenkin trooppisissa kehittyvissä maissa. Vuosittain sairastuu 250 000 ihmistä, vaikka Maailman terveysjärjestöllä WHO:lla oli tavoitteena eliminoida koko tauti jo vuosituhannen vaihteeseen mennessä. [4] Sen nujertamiseen käytetään monilääkehoitona kolmea eri lääkettä: rifampisiinia, dapsonia ja klofatsimiinia. [5]

Sairastuvien määrästä tekee mielenkiintoisen myös se, että aikuisista noin 95 prosentilla on luontainen vastustuskyky bakteeria vastaan ja jopa 99 prosentille väestöstä kehittyy riittävä suojaimmuniteetti, jotta mitään oireita ei synny. [1]

Kuva 2. Uudet lepratartunnat maittain vuonna 2010. 99 prosenttia väestöstä ei sairastu tai oireile - kuinka laaja epidemia syntyisikään ilman immuniteettia? [6]

Rampautunut leprabakteeri

Taudin leviäminen on muutenkin jokseenkin tehotonta: leprabakteerin jakautuminen on hitainta kaikista tunnetuista bakteereista sen jakautuessa vain kerran 11-13 päivässä. [3] Bakteeri on lisäksi solunsisäinen loinen, joten suurin osa tautia sairastavista ei edes levitä tautia. Oireet alkavat näkyä hitaasti itämisajan vaihdellessa kahdesta jopa kahteentoista vuoteen. Osittain tämän takia leviämistapaa ei ole todistettu vieläkään varmasti, mutta sen uskotaan leviävän pisaratartuntana hengitysteitse. [4]

M. lepraella on hitautensa lisäksi toinenkin ennätys kontollaan: lepra on vanhin ihmisen lajinomainen tauti, sillä leprabakteeri alkoi loisia ihmisapinoissa jo miljoonia vuosia sitten. Tästä ovat antaneet näyttöä tiedot ihmisen evoluutiosta ja bakteerin genomista. [7] Tietoa tukee myös bakteerin hiljattain löytynyt serkku Mycobacterium lepromatosis, joka on toiminnallisesti hyvin samankaltainen kuin lähisukulaisensa. [3]

Kuvassa 3 on vertailtu leprabakteerin genomia samaan luokkaan kuuluvan tuberkuloosibakteerin kanssa. Sopeutuessaan solunsisäiseksi loiseksi leprabakteerin genomi on pienentynyt ja proteiineja koodaavien geenien osuus pudonnut puoleen koko genomista, mikä on huomattavan vähäinen määrä. [8] Loput ovat evoluution myötä muuttuneet pseudogeeneiksi ja koodaamattomiksi alueiksi, kun elinympäristön vaihtuessa kilpailua elinympäristöstä ei ole enää ollutkaan. [7]

 

Kuva 3. Leprabakteerin genomi verrattuna samaan luokkaan kuuluvan tuberkuloosibakteerin genomiin. Toiminnallisten geenien osuus on lepralla vain puolet muutoinkin pienemmästä genomista, minkä takia se ei pysty enää selviämään tai lisääntymään itsenäisesti. [8]

Paras lämpötila leprabakteerin kasvulle on ihmisen ruumiinlämpöä alhaisempi 27-30°C. Tämän takia tartunta leviää herkimmin ääreishermoihin, ihoon ja nenän limakalvoihin, joiden lämpötila on sisempiä kehon osia alhaisempi. [3]

Mutta jos leprabakteeri kerran on hidas, tehoton, ekologiselta lokeroltaan nirso ja vieläpä kykenemätön selviämään ilman isäntäsolua, miten se oikein aiheuttaa niin hankalan taudin? Vastaus piilee bakteerin ensisijaisena kohteenaan käyttämissä Schwannin soluissa, joita se hyödyntää ennennäkemättömällä tavalla.

Schwannin solut - siis mitkä?

Schwannin solut ovat ääreishermoston hermotukisoluja. Ne kiertyvät ääreishermoston hermosyiden ympärille muodostaen erityisiä monikerroksisia kalvorakenteita, myeliinituppia, jotka mahdollistavat hermoimpulssien johtumisen ja antavat samalla suojaavan eristekerroksen hermosyille. Lisäksi hermosolujen ympärillä on myös myeliinittömiä Schwannin soluja. [9]

Lainaan tähän Ninnin aiempaan blogikirjoitukseen piirtämää hienoa hermosolua kuvaksi 4, kun siinä on kätevästi esitetty kaikki oleellinen muttei mitään turhaa.

Kuva 4. Hermosolun viejähaarakkeen ympärillä on myeliinituppia, jotka ääreishermostossa ovat Schwannin solujen muodostamia kalvorakenteita. Hieman oikoen siis kuvan keltaiset myeliinit ovat Schwannin soluja. [10]

Eli nämä solut ovat leprabakteerin ensisijainen kohde. Bakteerit kerääntyvät ensin hermojen pinnalla olevaan imukudokseen, josta ne levittäytyvät hermon pinnalla oleviin verisuoniin. Tartunnan keskipisteisiin kehittyy tulehdus, joka etenee ihon vammoista ihonalaisiin hermoihin ja hermosyykimppuihin, joista lopulta löytyvät Schwannin solut. [11]

Schwannin soluihin soluttautuminen...

Leprabakteeri hakeutuu ja kiinnittyy Schwannin solun pinnalle erityisellä soluseinänsä pinnalla olevalla proteiinilla, ML-LBP21:llä. [12] Proteiinin nimi tulee sanoista "Mycobacterium leprae, laminin binding protein, 21 kDa", mikä samalla kertookin sen sitoutuvan erityisesti laminiiniin, tarkemmin sanoen laminiini-2-proteiinin α2-ketjun G-domeeniin. [3] Oleellista tässä on se, että näitä α2-ketjuja on vain Schwannin solujen tyvilamellin pinnalla, eli bakteeri todella tietää, minne haluaa tarttua.

Leprabakteerin ja laminiinin muodostama kokonaisuus puolestaan sitoutuu Schwannin solun pinnalla oleviin α- ja β-dystroglykaaneihin. [1] Laminiini toimii myös siltana ML-LBP21:n ja Schwannin solun reseptoreiden välillä säädellen molekyylien ottamista solun sisälle. Bakteeri mokoma siis huijaa Schwannin solua ottamaan sen sisäänsä. [12]

...ja niiden kodiksi muuttaminen

Mutta vasta hiljattain on huomattu M. lepraen menevän vielä pidemmälle: loisinnan lisäksi se ohjelmoi Schwannin soluja uudelleen antaen niille kantasolumaisia ominaisuuksia. Tämä edistää tartunnan leviämistä poikkijuovaisiin ja sileisiin lihaskudoksiin. Ohjelmoinnin taustalla ovat samat molekyylit, jotka laittavat solun ottamaan bakteerin sisäänsä, mutta tällä kertaa ne käynnistävät signaaliketjun nimeltä Erk1/2. [13]

Kuvassa 5 on esitetty Erk1/2-signaaliketjun vaikutus vaiheittaisena kaaviona. Transkriptiotekijä Sox10:n potkiminen pois tumasta on suurin vaikuttava asia solun

ohjelmoinnissa takaisin kantasolun kaltaiseksi, sillä se on tarpeellinen tekijä Schwannin solun erikoistumisen ja myeliinin tuoton kannalta.

Kuva 5. Erk1/2-signaaliketjun aktivoiminen aiheuttaa transkriptiotekijän Sox10 ulos tumasta ajautumisen ja hajoamisen. Sox10 on tarpeellinen sekä myeliinin tuoton että Schwannin solun erikoistumisen kannalta, joten ilman sitä solu ohjelmoituu takaisin kantasolun kaltaiseksi. [14]

Kantasolumaisiksi ohjelmoidut Schwannin solut voivat erikoistua mesodermaalisiksi soluiksi (eli muun muassa erityyppisiksi lihassoluiksi sekä punasoluiksi) ja vetää puoleensa makrofageja, mikä johtaa laajamittaiseen bakteerien leviämiseen. Kantasolumainen Schwannin solu myös sopii paljon paremmin bakteerin ympäristöksi kuin erikoistunut solu, ja sopiva ympäristö tehostaa lisääntymistä ja leviämistä entisestään.

Loppuun vielä lyhyt tiivistelmä: leprabakteeri on hyvin hidas, leviää heikosti ihmisestä toiseen eikä pärjää ilman isäntäeliötä alkuunkaan. Sillä on kuitenkin pitkälle hiottu ja ainutlaatuinen mekanismi sopivan turvapaikan löytämiselle, sinne pääsemiselle sekä sen muokkaamiselle itselleen sopivaan tarkoitukseen. Vuosimiljoonien loisiminen on todella tehnyt tehtävänsä.

Lähteet:

1. Spierings E, De Boer T, Zulianello L & Ottenhoff TH (2000) Novel mechanisms in the immunopathogenesis of leprosy nerve damage: the role of Schwann cells, T cells and Mycobacterium leprae. Immunol Cell Biol 78(4): 349-355.

2. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/98/ COLLECTIE_TROPENMUSEUM_Opname_van_verminkte_handen_van_personen_die_aan_lepra_lijden_TMnr_60011679.jpg

3. Eichelmann K, Gonzalez Gonzalez SE, Salas-Alanis JC & Ocampo-Candiani J (2013) Leprosy. An update: definition, pathogenesis, classification, diagnosis, and treatment. Actas Dermosifiliogr 104(7): 554-563.

4. Rodrigues LC & Lockwood DN (2011) Leprosy now: epidemiology, progress, challenges, and research gaps. Lancet Infect Dis 11(6): 464-470.

5. http://www.who.int/lep/mdt/en/

6. http://www.newzfeed.org/wp-content/uploads/2014/06/leprosy-Map.jpg

7. Han XY & Silva FJ (2014) On the age of leprosy. PLoS Negl Trop Dis 8(2): e2544.

8. Suzuki K, Akama T, Kawashima A, Yoshihara A, Yotsu RR & Ishii N (2012) Current status of leprosy: epidemiology, basic science and clinical perspectives. J Dermatol 39(2): 121-129.

9. Masaki T (2012) Polarization and myelination in myelinating glia. ISRN Neurol 2012: 769412.

10. biople.blogspot.com/2015/01/aivoista-asiaa-osa-1.html

11. Scollard DM, Truman RW & Ebenezer GJ (2015) Mechanisms of nerve injury in leprosy. Clin Dermatol 33(1): 46-54.

12. Shimoji Y, Ng V, Matsumura K, Fischetti VA & Rambukkana A (1999) A 21-kDa surface protein of Mycobacterium leprae binds peripheral nerve laminin-2 and mediates Schwann cell invasion. Proc Natl Acad Sci U S A 96(17): 9857-9862.

13. Masaki T, Qu J, Cholewa-Waclaw J, Burr K, Raaum R & Rambukkana A (2013) Reprogramming adult Schwann cells to stem cell-like cells by leprosy bacilli promotes dissemination of infection. Cell 152(1-2): 51-67.

14. Wegner M (2013) Mighty bugs: leprosy bacteria turn schwann cells into stem cells. Cell 152(1-2): 15-16.